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Definire la filariale N
Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 7951 (2023) Citare questo articolo
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La glicosilazione N-linked è una modifica post-traduzionale critica delle proteine eucariotiche. I glicani N-legati sono presenti sulla superficie e sulle proteine filariali secrete che svolgono un ruolo nelle interazioni con il parassita ospite. Esempi di proteine glicosilate di Brugia malayi sono stati precedentemente identificati, ma non è stato effettuato uno studio sistematico del glicoproteoma N-linkato di questo o di qualsiasi altro parassita filariale. In questo studio, abbiamo applicato un protocollo N-glico FASP potenziato utilizzando una proteina ingegnerizzata che lega i carboidrati, Fbs1, per arricchire i peptidi N-glicosilati per l'analisi mediante LC-MS/MS. Abbiamo quindi mappato gli N-glicositi sulle proteine dei tre stadi ospiti del parassita: femmina adulta, maschio adulto e microfilarie. L'arricchimento di Fbs1 di peptidi N-glicosilati ha migliorato l'identificazione degli N-glicositi. I nostri dati hanno identificato 582 glicoproteine legate all'N con 1273 N-glicositi. L'ontologia genetica e la previsione della localizzazione cellulare delle N-glicoproteine identificate hanno indicato che si trattava principalmente di proteine di membrana ed extracellulari. Confrontando i risultati di vermi femmine adulte, vermi maschi adulti e microfilarie, troviamo variabilità nella N-glicosilazione a livello proteico così come a livello individuale di N-glicosite. Queste variazioni sono evidenziate nelle N-glicoproteine della cuticola e nelle N-glicoproteine ristrette nei vermi adulti come esempi di proteine all'interfaccia del parassita ospite che sono ben posizionate come potenziali bersagli terapeutici o biomarcatori.
Brugia malayi è uno dei tre parassiti filariali umani che causano la filariosi linfatica, una malattia tropicale debilitante e cronica trascurata che attualmente minaccia più di 859 milioni di persone in 50 paesi in tutto il mondo1,2. I sintomi negli individui possono variare da lievi a gravi, compresi danni al sistema linfatico e ai reni e possibile ostruzione dei vasi linfatici con gonfiore dei genitali e degli arti1,2. I vermi adulti che risiedono nel sistema linfatico di individui immunocompetenti possono sopravvivere in media per 6-8 anni. I vermi femmine rilasciano milioni di microfilarie (larve immature), che si fanno strada nel flusso sanguigno dove possono essere ingerite nutrendosi delle zanzare, gli insetti vettori di questi parassiti. All'interno delle zanzare, le microfilarie mutano e si sviluppano attraverso diversi stadi fino al terzo stadio larvale infettivo (L3) che può poi essere trasmesso con un pasto di sangue ad altri esseri umani. Queste larve L3 poi mutano e maturano mentre migrano nel sistema linfatico dove completano il ciclo vitale1,2. Sono stati forniti più di 7 miliardi di trattamenti in 66 paesi per combattere la filariosi linfatica come parte dell’impegno dell’OMS per eliminare la malattia1,3. Gli attuali trattamenti, pur essendo efficaci nel ridurre la trasmissione riducendo o eliminando le microfilarie circolanti nel sangue, non uccidono i vermi adulti responsabili dei sintomi associati alla filariosi3,4. Inoltre, sono state effettuate segnalazioni di resistenza emergente ai trattamenti attuali5,6. Per espandere le misure di controllo disponibili, sono necessari ulteriori studi per aumentare le opzioni farmacologiche disponibili e gli obiettivi farmacologici.
Le interazioni mediate dai parassiti con l'ospite mammifero, come l'immunomodulazione e l'evasione immunitaria, consentono a B. malayi e altri parassiti filariali di esistere per molti anni in ospiti immunocompetenti e rappresentano un'attiva area di indagine7. I glicoconiugati presenti sulla superficie del verme, secreti, escreti o presenti nelle vescicole extracellulari rilasciate dal parassita nell'ospite fanno tutti parte di meccanismi cruciali che consentono a questi parassiti di esistere per anni senza eliminazione8,9,10,11. La caratterizzazione dettagliata di queste molecole critiche e dei loro percorsi di sintesi può evidenziare biomarcatori candidati, bersagli terapeutici, molecole di vaccino o strumenti diagnostici per un ulteriore sviluppo. Ad esempio, l'attuale test diagnostico per la filariosi linfatica è il rilevamento dell'antigene filariale circolante di Wuchereria bancrofti mediante un anticorpo monoclonale12. Studi recenti hanno dimostrato che l'epitopo riconosciuto è un glicano e sono necessari ulteriori studi per caratterizzare completamente la struttura13.
For parasitic nematodes, the host parasite interface can be defined as the cuticle or outer exoskeleton covering of the worm, excretory-secretory (ES) components, and extracellular vesicles. Early studies of filarial worm cuticle proteins identified two B. malayi glycoproteins. gp29 (Bm2151) is a major surface glycoprotein found in the cuticle of adult worms with homology to the glutathione peroxidases that are part of the oxidative stress response22. gp15/400 (Bm6083 or Bm6084, Bma-npa-1) is a nematode polyprotein allergen related glycoprotein found in the cuticle of the adult worms and is thought to play a role in acquiring the required fatty acids that the worms cannot synthesize de novo22,23. Recently, gp15/400 was described as an immunodominant antigen targeted by human IgE monoclonal antibodies produced from parasite infected human sera24. Later studies broadened the number of cuticle associated proteins but little is known about their glycosylation status25. ES-62 (Bm9816) is a major secreted glycoprotein in filarial nematodes26,27 and of special interest due to immunomodulatory phosphorylcholine substitution of its N-glycans8,9,26. Larger proteomic studies of excreted and secreted proteins28,29, extracellular vesicle proteins30 and membrane or surface enriched proteins31 highlighted more proteins that are exposed to the mammalian host. However, the possibility of glycan-mediated interactions with the host were not addressed in these strictly proteomic analyses. N-linked glycosite mapping in Caenorhabditis elegans, a soil living nematode, identified 829 N-linked glycoproteins in one study and 1010 N-linked glycoproteins in a second21,32. These studies that identified over a thousand N-glycoproteins included all stages (egg, L1, L2, L3, L4, and adult worms) of the nematode life cycle (2015)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR33" id="ref-link-section-d12369696e568"33. A recent glycosite mapping of a Clade V34 parasitic nematode, Haemonchus contortus, identified 291 N-linked glycoproteins35 from only a mixed adult worm sample./p> We used NetNGlyc-1.046 to find the canonical N-X-S/T glycosites present in each N-glycoprotein. We used Weblogo47 to create a sequence logo for extracted -10 to + 10 amino acid sequences. We used BioVenn48 to generate a proportional Venn diagram. We used TMHMM-2.049 to predict transmembrane domains. We used UpsetR50 to generate UpsetR intersecting set plots. The gene ontology identification and functional enrichment analysis was performed using g:Profiler (version e105_eg52_p16_e84549f.) with g:SCS multiple testing correction method applying significance threshold of 0.0551. We used ggplot (2016)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR52" id="ref-link-section-d12369696e755"52 to generate scatter plots from gene enrichment data analysis. We used DeepLoc to predict subcellular localization for each N-glycoprotein53. We used Parasite Biomart at Wormbase to search for both C. elegans and H. contortus orthologs to identified B. malayi N-glycoproteins54. We used Clustal Omega to generate a multiple sequence alignment55./p>